Western样本制备方法之一蛋白提取

Post published:2016-08-08
Post category:生物资讯
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作者：联科生物发布日期：2016-08-08 13:00

样本制备是Western实验的第一步，也是决定实验成败的关键步骤，获得的蛋白质样品必须均质、可溶，并解离成单个多肽亚基，且尽量减少相互间的聚集，使其最终仅依赖本身的分子量大小进行分离。常见的Western样本来源有重组蛋白、细胞和组织等，基本步骤可以分为三步：第一步获取材料，提取目的蛋白；第二步蛋白定量；第三步制备电泳上样样品。首先我们介绍第一步：蛋白提取。

蛋白提取的总原则和注意事项：
1. 尽可能提取完全或降低样本复杂度，只集中提取目的蛋白；

2. 保持蛋白处于溶解状态（通过裂解液的pH盐浓度，表面活性剂，还原剂等的选择）；

3. 提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等（低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂）；

4：尽量除去核酸、多糖、脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）；

5：样品分装，长期于-80℃保存，避免反复冻融。

细胞裂解
1. 培养的细胞经预冷的PBS漂洗2次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂；

2. 吸尽PBS，加入预冷的裂解液（1ml per 107 cells/100mm dish/150cm2 flask）；

3. 用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中；

4. 4℃摇动30mins；

5. 4℃，12000rpm离心20mins；

6. 轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀。

组织裂解
1. 用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解；

2. 将组织放在圆底微量离心管或EP管中，加入液氮冻结组织于冰上匀质研磨，长期可保存于-80℃；

3. 每5mg加入约300ul预冷的裂解液，冰浴匀浆后置于4℃摇动2小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例（最终的蛋白浓度至少达0.1mg/ml，理想的蛋白浓度应为1-5mg/ml）；

4. 4℃，12000rpm离心20mins，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀。

Western样本制备相关产品—细胞裂解液

目录号	WB019	WB020	WB021	WB022	WB023	WB024
产品名称	RIPA裂解液(中)	RIPA裂解液(强)	RIPA裂解液(弱)	Western及IP细胞裂解液	NP-40裂解液	SDS裂解液
有效裂解成分	1% NP-40, 0.5% deoxycholate,0.1% SDS	1% Triton X-100, 1%deoxycholate,0.1% SDS	1% NP-40, 0.25%deoxycholate	1% Triton X-100	1% NP-40	1% SDS
裂解强度	中	强	温和	温和	温和	强
膜蛋白的提取	较好	很好	一般	一般	一般	很好
胞浆蛋白的提取	很好	很好	很好	很好	很好	很好
核蛋白的提取	较好	很好	较好	较好	较好	较好
胞浆磷酸化蛋白提取	很好	很好	很好	很好	很好	很好
细胞核转录因子提取	很好	很好	很好	很好	很好	很好
主要用途	WB, IP	WB, IP	WB, IP, co-IP	WB, IP, co-IP	WB, IP, co-IP	WB, ChIP