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流式细胞术知识分享——应用篇

作者:小科    发布日期:2021-12-13 09:00


流式细胞术在过去30年里得到迅速发展,在免疫学、分子生物学、细菌学、病毒学、癌症生物学和传染病学等领域得到广泛应用。比如,流式细胞术对研究免疫系统状态及其对传染病和癌症的反应非常重要,它可以表征来自血液和骨髓的混合细胞群,以及由淋巴结、脾、粘膜组织、实体肿瘤等固体组织分解成的单个细胞。除了分析细胞外,流式细胞术另一个主要应用是对细胞进行分选,以满足使用者进一步的分析需求。本文将主要以免疫学和分子生物学为例,介绍流式细胞术在实际中的应用。
 

 


免 疫 学


免疫分型

免疫分型在流式细胞术的应用中最常见,它利用流式细胞术的独特能力同时分析混合细胞群的多个参数。免疫分型最基本的形式就是使荧光偶联抗体与细胞表面对应的抗原特异性结合,之后利用流式细胞仪,根据细胞表面的荧光对细胞做出分析。大多数抗原都有特定的分化亚群编号或者CD编号,对应的抗体用相同的方式命名。
 


大多数免疫细胞都有特定的CD标记,这些细胞标记称为谱系标记,用于定义特定细胞群,以便在每个免疫分型实验中进行额外分析。例如T细胞标记物(CD3, CD4, CD8), B细胞标记物(CD19, CD20),单核细胞标记物(CD14, CD11b)和NK细胞标记物(CD56, CD161)。
 


除了定义细胞群的谱系标记外,还使用其他标记来描述每个细胞群的特征。这些标记包括激活标记(CD69、CD25、CD62L)、记忆标记(CD45RO、CD27)、组织归巢标记(α4/β7)和趋化因子受体标记(CCR7、CCR5、CXCR4、CCR6)等。通常,免疫分型还针对细胞内标记物,如FoxP3(定义Treg细胞)、细胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2定义Th1细胞)、增殖标记物(Ki67、CFSE)和抗原特异性标记物等。


抗原特异性反应

在抗原特异性反应中,使用特定抗原刺激细胞,之后通过MHC多聚体来寻找细胞因子产生、细胞增殖、细胞激活、细胞记忆或抗原识别等。MHC多聚体是生物素化的MHC单体(MHC-I或MHC-II)以四聚体、五聚体或右旋聚体的形式结合在荧光链霉亲和素骨架上。这些MHC多聚体被“装上”特定的抗原,之后与识别该抗原的T细胞结合,用来表明T细胞对特定抗原的反应水平。抗原特异性反应通常用于疫苗研究。


胞内因子检测

胞内细胞因子检测通常使用蛋白转运抑制剂(Brefeldin A或Monensin)处理细胞2-12小时,使细胞产生的各种细胞因子在胞内积累,便于更好地检测。在这个处理过程中,细胞可以被各种抗原刺激(例如疫苗中的多肽),以检测细胞的免疫反应。在蛋白质转运抑制剂处理完毕后,对细胞进行活力标记和细胞表面标记染色,之后进行固定和渗透,以使细胞因子抗体进入细胞内染色。


细胞增殖检测

细胞增殖可以通过几种不同方法来测定,这些方法可靶向与细胞增殖相关的事件,例如将胸苷类似物 (BrdU) 掺入复制中的DNA、可遗传永久染料的世代跟踪、增殖相关抗原(Ki67、PCNA)的表达检测等。


细胞凋亡检测

流式细胞术利用与凋亡相关的级联事件的靶点进行细胞凋亡检测:膜联蛋白 V (Annexin V)靶向易位的细胞质膜进行染色;TUNEL(TdT dUTP Nick End Labeling)靶向内切酶消化的DNA进行标记;抗体和染料靶向半胱天冬酶(Caspases)的激活;确定线粒体膜电位的染料靶向线粒体凋亡;Hoescht 33342靶向细胞核中的染色质凝聚。
 


Annexin V是一种磷脂结合蛋白,能够与细胞凋亡过程中被转运到细胞膜外表面的磷脂酰丝氨酸结合。Annexin V应与排除活性染料(如碘化丙啶)联合使用,以确保Annexin V与磷脂的结合发生在细胞膜外表面。


TUNEL是一种利用末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)的能力,用dUTP(脱氧尿苷三磷酸)或BrdU标记与凋亡相关的DNA断裂末端的技术。dUTP或BrdU用荧光色素标记用于检测,在数据采集之前用DNA染料对细胞进行反染色。



Caspase信号通路会在大多数细胞凋亡过程中被激活,其产生的活化Caspase 3能够被相应的细胞内染色剂和抗体特异性结合。


检测线粒体凋亡最常用的方法是使用染料JC-1来检测线粒体膜电位。此外,有一种抗体可针对APO2.7——一种仅在细胞凋亡过程中表达且定位于线粒体膜上的蛋白。
 


分 子 生 物 学


荧光蛋白检测
荧光蛋白(GFP、mCherry、YFP、mRuby等)常被用作蛋白质表达的标记,即细胞被转染含有启动子序列、目的基因序列和荧光蛋白序列的质粒。当目的基因表达产生目的蛋白时,其下游的荧光蛋白基因共同表达,从而使细胞发出荧光信号。该技术应用于多种研究,例如在体内追踪移植细胞,检测细菌或病毒感染,以及鉴定基因功能等。
 



细胞周期检测
细胞周期检测使用饱和量的DNA结合染料对DNA进行染色。在大多数情况下,使用70%乙醇溶液固定细胞,使细胞通透,然后使用染料(PI, 7AAD, DAPI)染色。此外,个别染料可以进入活细胞,在不伤害细胞的情况下染色DNA,比如Hoescht 33342。在细胞周期检测中,以低流速线性放大的方式采集样本,然后使用倍性建模软件进行分析,以确定细胞周期阶段。



RNA检测

RNA流式细胞术将传统流式细胞术和荧光原位杂交(FISH)结合应用,检测RNA表达和蛋白表达。当无法检测目标蛋白表达,但可以检测RNA表达时,这种技术就可以发挥作用。


细胞分选

细胞分选利用流式细胞分选仪来分离纯化细胞或颗粒以供进一步分析。基本上,任何具有荧光的细胞或颗粒都可以被分选。细胞可以被分选到96孔板、384孔板、管中和载玻片上。常见的样本有表达荧光蛋白的转染细胞、干细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、肿瘤细胞和白细胞群。细胞分选需要考虑的一个主要因素,是对大量细胞进行染色时,增加所需的抗体量。
 

 


其 他 应 用


绝对细胞计数

绝对细胞计数可用于任何免疫分型研究,该技术利用随样本一起采集的已知浓度的荧光珠对样本进行分析,并将目的细胞群的门控数量与在同一样本中获得的荧光珠数量进行比较,以计算生成单位体积内的细胞数量。


小颗粒检测和分选

使用高灵敏度的流式细胞仪,可以检测和分选外泌体和其他亚微米颗粒。细胞外泌体、病毒和其他颗粒的分析在多个领域得到应用,包括癌症生物学、癌症治疗和疫苗开发。

随着不断发展,近年来,流式细胞术也开始在吞噬作用分析、多重微珠阵列检测、细胞定量分析等研究中得到应用。

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