• 欢迎来到联科生物!
  • 证券代码: 831936
请登录|注册
  • 400-6721-600 400-6721-600
首页 > 生物资讯 > 技术资料 > ELISA常见类型二 | 竞争法,五分钟搞定!

ELISA常见类型二 | 竞争法,五分钟搞定!

作者:小科    发布日期:2021-12-09 15:00



竞争法ELISA(也称抑制或封闭法ELISA)通过定量某种样品分析物对预计信号的干扰,来测定该分析物在样品中的含量,可通过以下方式进行:微孔板用一种分析物或一种对靶标分析物具有特异性的抗体包被(即直接法和间接法),再添加一种有部分某种检测的靶标分析物,以竞争结合抗体上的位点。信号与分析物含量呈负相关,因此,如果靶标分析物的浓度较分析物高,靶标分析物竞争性结合有限量的标记抗体,参考信号将会较靶标分析物的浓度较低的情况增强。


竞争法的理论基础是限量抗体,只有在限量抗体基础上,两种抗原才会形成竞争关系。该方法一般用来检测具有较少表位的小分子物质。

 

实 验 概 要


以直接竞争法ELISA为例,将特异性抗体吸附于固相载体,加入待测抗原(标准品或样本)和生物素标记的检测抗原,二者竞争与固相抗体结合,然后加入辣根过氧化物酶标记的亲和素,经过温育和彻底洗涤后加入显色底物。显色的深浅与样品中待测物质含量呈负相关。


1) 准备所有的试剂和梯度稀释的标准品。板条加入洗液静置浸泡30 秒。



2) 标准品孔加入2倍倍比稀释的标准品;非特异性结合(NSB)和最大结合(B0)孔加入标准品稀释液或培养基。

3) 血清/血浆:样本孔加入样本;细胞培养上清:样本孔加入细胞培养上清。

4) 除了Blank和非特异性结合(TA)孔空白,NSB孔加入1×检测缓冲液,其余每孔加入稀释的偶联物。

5) 封膜,室温孵育1小时,洗涤6次。



6) 除了TA和Blank孔,其余每孔加入稀释的HRP标记的链霉亲和素。

7) 封膜,室温孵育30分钟,洗涤6次。

8) TA孔加入稀释的HRP标记的链霉亲和素。

9) 每孔加入显色底物,避光,室温孵育5 - 30分钟。

10) 每孔加入终止液。

11) 30分钟内,在450nm波长检测OD值,参考波长570nm或630nm。


注:以上步骤是以联科生物ELISA试剂盒为参考,不同厂家的试剂盒操作步骤可能不一样,开始实验前一定要仔细阅读产品说明书哦~

 


直接竞争法和间接竞争法的区别


1)标记

• 直接竞争法:标记抗原,与检测样品中的抗原竞争抗体;

• 间接竞争法:标记抗体,固相抗原与检测样品中的抗原竞争标记抗体。


2)模型

• 直接竞争法:包被抗体,用HRP-抗原与样本一起加入。样本中的Ag与HRP-Ag竞争Solid-Ab,固相吸附的HRP-Ag与样本中的Ag浓度成反比;

• 间接竞争法的模型:包被抗原,用HRP-抗体与样本一起加入。样本中的Ag与Solid-Ag竞争HRP-Ab,固相吸附的HRP-Ab与样本中的Ag浓度成反比。


3)结合机会

• 直接竞争法:标记抗原与待测抗原均是液相,与抗体的结合机会是一样的;

• 间接竞争法:固相抗原与抗体的接触面积较小,固相抗原与待测抗原的结合抗体机会是不平等的,接近顺序饱和法,即只有与待测抗原结合剩余的抗体才会与固相抗原结合。


4)系统放大

• 直接竞争法:一般难以进行放大,常用的有生物素化抗原与酶标亲和素;

• 间接竞争法:一般可以使用酶标二抗。


5)灵敏度 

• 间接竞争法灵敏度大于直接竞争法。

• 由于结合机会的差异,间接法的抑制率大于直接法,从而抑制曲线斜率会大于竞争法,故灵敏度越大。在进行系统放大时,间接法一般可以使用酶标二抗,进一步提高灵敏度。

 

小 拓 展
 

竞争法ELISA也可以用来检测大分子抗原甚至是抗体。检测大分子抗原时,由于空间位阻的影响,使得该检测方法没有双抗体夹心法灵敏度高。检测抗体时,由于两种竞争的抗体来源不一,两种抗体趋同性不高,导致检测结果的可信性不高。

今日推荐
  • 1

总排行

著名的ACE2来啦—11月ELISA新品
联科生物ELISA试剂盒新品不断,11月份,我们成功推出...[详情]
10月新品之趋化因子配体CXCL16及粘附分子L-Selectin
CXC趋化因子配体16(CXCL16)是一种CXC可溶性趋化因子、...[详情]
Nature video超好玩小视频解读PD-1/PD-L1
PD-1(programmed death 1),即程序性死亡受体-1;PD-L1(Programme...[详情]
10月ELISA新品之死亡受体Fas/CD95
Fas/CD95是一种319个氨基酸的I型跨膜糖蛋白, 是死亡受体...[详情]
9月ELISA新品之PDGF-BB与IL-20
1. 血小板生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)家...[详情]
敲黑板:和师兄师姐谈未来提到的高频词
联科生物试剂发表SCI论文超过1000篇↓↓↓最高性价比国...[详情]
IL-35与热门疾病研究,你会pick谁
白细胞介素35 (IL-35)是由调节性T细胞产生的细胞因子,...[详情]
PD-1抗体药物:免疫治疗领域的“当红明星”
新里程美家国际医疗中心指出:当人体免疫内环境出现...[详情]
联科生物Maxi ECL kit助创科研奇迹
北京时间5月11日,浙江万里学院葛楚天团队在 Science 杂...[详情]
  • 客服热线 客服热线
    400-6721-600
  • 客服QQ 客服QQ
    400 6721 600
  • 产品订购 产品订购
    order@liankebio.com
  • 售后服务 售后服务
    tech@liankebio.com
在线客服
在线客服
  • 服务热线400-6721-600
    工作时间
    8:30-17:30
二维码
地址:中国杭州市萧山区闻堰街道天马路1688号2幢301室