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流式细胞术知识分享 一 仪器篇

作者:小科    发布日期:2021-12-02 10:00


流式细胞术是一种对溶液中单个细胞或颗粒进行快速、多参数分析的技术。流式细胞仪利用激光作为光源,照射在细胞上,产生散射光和荧光信号,由检测器如光电二极管或光电倍增管读取。之后,这些信号被转换成电子信号,由计算机进行分析,并写入标准格式(.fcs)数据文件。另外,细胞群可以根据其荧光或散射光的特性进行分析或分选。



用于流式细胞术的仪器在过去的几十年里不断“进化”着,以满足越来越多的科研与临床应用需求。本文将为大家简单介绍几种流式细胞仪。


传统流式细胞仪


传统的流式细胞仪由液流、光学和电子(检测分析)三个系统组成。液流系统主要由鞘液(通常是一种缓冲盐水溶液)构成。在一定压力下,鞘液将细胞或颗粒聚焦在一条直线,并将其输送到激光拦截点。


光学系统由激发光 (激光器)和收集光 (光电倍增管或PMTs和光电二极管)组成,产生用于分析样品的散射光和荧光信号。一系列的双色向滤光片可引导荧光到特定的探测器,以便每一个单独的荧光色素可以被检测和测量。更具体地说,双色向滤光片只允许波长较短或较长的光通过,并以一定角度反射不能通过的光。例如,450双色向长通滤光片(DLP)让波长大于450 nm的光通过滤光片,并以一定角度反射较短波长的光,发送到另一个探测器。带通滤光片只允许一定波长范围内的荧光通过。例如,450/50带通滤光片只允许波长为450 +/- 25 nm的荧光通过。


电子系统将探测器发出的信号转换成可以被计算机读取的数字信号。


常见的多激光系统通常有20个参数(FSC, SSC和18个荧光探测器)。目前,一些新的仪器正在引入5个或更多的激光器,并设置30-50个参数,但这并不常见。传统流式细胞仪使用的最常见的激光是488 nm(蓝色)、405nm(紫色)、532nm(绿色)、552nm(绿色)、561 nm(绿黄色)、640 nm(红色)和355 nm(紫外线),还有一些不常见的激光可用于特定用途。此外,还有一些仪器已经用电子崩光电二极管(APD)取代光电倍增管(PMT)用于荧光检测,目的是提高检测的灵敏度。


流式细胞仪系统组成示意图


声波聚焦流式细胞仪


声波聚焦流式细胞仪可以使用超声波更好地将细胞聚焦于一条直线,进行激光照射。即使在较高的进样速度下,声波聚焦技术也可以精确地将细胞定位在液流的中心,因此细胞信号的变异系数较小,数据质量更高。作为对比,同样在高进样速度下,传统的流体动力学聚焦由于鞘液压力相对变小,样本流的中心部分变宽,导致信号变异系数增大、数据质量下降。此外,声波聚焦的方式允许更高的上样量,并能够减少样品堵塞。声波聚焦流式细胞仪可以利用多达4种激光和14个荧光通道对样本进行检测。


声波聚焦和流体动力学聚焦对比示意图


细胞分选仪


细胞分选仪是传统流式细胞仪中的一种特殊类型,它允许用户根据所需参数,选择特定的细胞群或颗粒群,然后将这些细胞或颗粒引导到收集容器中,以供进一步研究。


细胞分选仪对样品液流进行高频振荡,以产生液滴来分离细胞。然后,液滴被赋予正电荷或负电荷,并通过金属偏转板,在那里它们根据电荷被导向一个特定的收集容器。收集容器可以是管状、载玻片或板状(96孔或384孔较为常见)。


细胞分选仪有两种类型,石英比色皿型和喷气管型,它们的不同之处在于激光照射点的位置。石英比色皿型细胞分选仪具有固定的激光照射线路,更容易为分选做好准备。喷气管型细胞分选仪需要每天对激光照射线路进行校准,设置起来更困难,但更适合小颗粒检测。


流式细胞分选仪


成像细胞仪


成像流式细胞仪(IFC)结合了传统的流式细胞术和荧光显微镜系统,这允许在单细胞和群体细胞水平上快速分析样品的形态和多参数荧光。IFC可以像共聚焦显微镜或荧光显微镜那样跟踪单个细胞内的蛋白质分布,也可以像流式细胞仪那样处理大量细胞。它们在多种应用中发挥关键作用,如细胞信号传导、共定位研究、细胞间相互作用、DNA损伤和修复,以及需要对大量细胞的细胞定位与荧光表达进行协调的应用。


质谱流式细胞仪


质谱流式细胞仪结合了飞行时间质谱仪和流式细胞仪的功能。使用这种仪器时,细胞用重金属离子标记抗体进行标记,而不是荧光标记抗体,并使用时间飞行质谱法进行检测。但质谱流式细胞仪不具备FSC 或 SSC 光检测功能,因此无法使用常规方法检测细胞聚集体。此外,质谱流式细胞术不具有细胞自身荧光信号,试剂不具有与荧光标记相关的发射光谱重叠,因此不需要补偿。然而,样品在分析过程中会被破坏,因此无法进行细胞分选,并且采集速率远低于标准流式细胞仪。


用于微珠阵列分析的细胞仪


多重微珠阵列在分析小体积样品中的大量分析物方面已变得流行。简单地说,这些检测利用在特定通道中具有已知荧光量的捕获珠和由单独的激光检测到的报告分子,来量化与特定珠相关的捕获分析物的数量。


光谱分析仪


多参数流式细胞术的挑战之一是荧光色素之间的补偿(或消除光谱重叠)。一种新型的流式细胞仪,光谱分析仪就是专门针对这一问题而设计的。光谱分析仪测量多色样品中每个荧光色素的整个荧光发射光谱,以创建光谱指纹。然后在分析过程中,每个光谱是未混合的,为每个荧光色素提供一个纯信号。光谱分析正逐渐取代传统的PMTs作为高维流式细胞术的检测方法。

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