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叮!联科向您投递了个ELISA实验操作干货包,请查收~

作者:小科    发布日期:2021-11-09 10:00




包裹一 样本如何处理、收集、保存?


1.细胞培养上清

细胞培养液在2500rpm/min 离心20分钟后,收集上清即刻检测, 或者分装,-20℃贮存。避免反复冻融。

2.血清样本

分离管分离血清。在1000g离心之前,使血样凝集30分钟。吸取血清样本之后即刻检测,或者分装,-20℃贮存。避免反复冻融。

3. 血浆样本

EDTA、枸橼酸钠或肝素抗凝收集血浆样本。在血样收集3分钟内离心收集样本。即刻检测,或者分装,-20℃贮存。避免反复冻融。
注:不要使用严重溶血或高血脂的样本。所有样本收集后,应及时分装并贮存于-20℃。如果在24小时内检测,样本可以存放在2 - 8℃。避免样本的反复冻融。在分析前,冷冻样本应该缓慢的恢复至室温,轻柔地混匀。检测前,样本中可见的沉淀必须去除。


包裹二 已设阴性对照,还需空白对照吗?


首先要清楚空白对照和阴性的区别。空白对照:仅用稀释液代替检测样本,用以观察最终反应的显色“本底”,并用于酶标仪消除、扣除“本底”,即以本底为“零’,读取阳性、阴性对照孔和样本孔的吸光值。阴性对照:是本实验检测与待检物有同源性和同质性,又不含有待检物质,并能客观比较和鉴别处理因素之间的差异。


包裹三 出现白板,什么原因呢?

如果显色完成后,肉眼可见整板没有显示反应,可能原因及应对方法详见下表。

 

序号

可能原因

解决方案

1

试剂盒储存不当;不同试剂盒试剂混用

购买新的试剂盒,注意储存条件;不可混用

2

孵育温度低,时间短

如果温度偏低,则延长孵育时间和显色时间

3

错加、漏加试剂

严格按照说明书步骤添加正确试剂

4

用于配置溶液的容器不干净,或水有问题

使用干净容器以及合格的蒸馏水

5

检测抗体和/或HRP浓度太低

参照说明书,不可随意稀释

6

试剂温度不均一

所有试剂要室温平衡 30 min

7

洗板过程中浸泡时间长,洗板次数太多,洗板冲击力大

严格按说明书操作



包裹四 出现花板,什么原因呢?


花板是指空白、阴性、阳性对照以及室内质控孔结果正常,而标本孔的吸光度(OD 值)却明显偏高,可能原因及应对方法详见下表。
 

序号

可能原因

解决方案

1

洗涤次数少,不充分

按说明书要求洗涤

2

底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB )被金属离子
或氧化剂污染或曝光

配置时使用干净容器以及合格蒸馏水;避光保存

3

孵育温度高和/或时间过长

控制孵育和最后酶促反应的温度和时间

4

加样时未更换枪头,造成交叉污染

每个样都更换枪头

5

附近孔交叉污染

洗涤时,洗液不可溢出孔洞,垂直拍板;

使用合适的拍板纸,避免孔内进入纸屑尘渣;

孵育时封板要严密,防止阳性标本的液体蒸发

6

样本存在内源性干扰物质

推测可能的感染物质,并进行对应处理

7

样本溶血、贮存过久、凝集不全、被细菌污染、
采血管中添加物影响等

避免溶血、污染、过久储存等现象

 


包裹五 标曲不佳,什么原因呢?


ELISA 实验中标准品进行了倍比稀释,但标准曲线最高点 OD 值偏高或偏低,且没有梯度,可能原因及应对方法详见下表。当然,也会存在酶标板封闭不足、本底不稳定的情况。

 

结果

可能原因

解决方案

标曲最高OD太高
(> 3.0)

TMB 孵育时间太长

调整孵育时间

指纹、杂质影响

双波长检测,去背景

标曲最高OD正常

标准品进行下一步稀释前没有混匀

先混匀,再移液

不同试剂盒或批号的试剂混用

不能混用

检测抗体浓度过高

按照说明书调整到最佳浓度

孵育时未加盖导致挥发和污染

贴封片或加盖

孔间污染

加样及洗板时防止孔间污染

标曲最高点OD低

(< 0.8)

显色时间不够

S1、S2深蓝色,梯度明显,S5有淡蓝色时可终止

粉末标准品未充分溶解

粉末标准品按说明书加一定体积的液体后,轻柔混匀,
室温静置 30 min,充分溶解

标准品反复冻融

标准品反复冻融后活性降低;购置新的标准品

孵育温度、时间

所有试剂室温(~25 ℃)平衡 30 min,
孵育时间按照说明书指示

洗涤浸泡时间过长

按照说明书操作,勿人为增加浸泡时间

酶标板在贮存或洗后拍干时过分干燥

防止板过于干燥

不同试剂盒或批号的试剂混用

不能混用

显色液变质

更换新的显色液

 


包裹六 标曲正常,样本吸光值极低,什么原因?

 

ELISA 实验中标准品进行了倍比稀释,但标准曲线最高点 OD 值偏高或偏低,且没有梯度,可能原因及应对方法详见下表。当然,也会存在酶标板封闭不足、本底不稳定的情况。


此外,如果肉眼观察酶标板显色正常,而上机所测 OD 异常,可检测酶标仪参数的设定以及滤光片是否匹配。洗涤液多为非离子型中性缓冲液,既含有亲水集团,也含有疏水基团,可以使吸附在酶标板上的蛋白解离而溶于水中,去除非特异性吸附物质,但是浓度太高时,会引起包被抗体脱落。所以需要正确稀释。同时应该用高质量的纯净水稀释,不能引入别的离子,以免对抗原抗体结合和酶促反应产生影响。
 

序号

可能原因

解决方案

1

样品不适合做 ELISA 检测

样品一般选择培养上清、血清、血浆。

其他样品形式可能不适合做 ELISA 检测或者需要优化检测的条件

(例如稀释液的成分)

2

样本含量低于灵敏度

浓缩样本或使用高敏试剂盒,避免反复冻融

3

样本存于吸附性强的试管中

选择蛋白吸附能力低的硅化 EP 管

4

冻融后,蛋白凝集,分布不均

样本避免反复冻融

 

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