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实验时间 | 流式实验胞外/核内步骤小结

作者:小科    发布日期:2021-07-19 09:00




单 细 胞 悬 液 制 备


细胞


材料:

消化酶、流式染色缓冲液(推荐目录号70-S1001)、15 or 50 ml流式管

操作过程:

1. (悬浮细胞) 离心收集细胞,细胞计数到合适浓度,然后进行如下第三步。

2. (贴壁细胞)、 用合适的酶消化细胞然后离心收集,细胞计数到合适浓度,进行如下第三步。

注意:酶消化很容易破坏细胞抗原表位。其中胰酶损害最厉害,推荐Accutase酶(推荐目录号70-AT001)。

3. (推荐)加入含血清的PBS或者含血清的细胞培养基终止蛋白酶反应。原因血清中含有抗蛋白酶成分,起到中和作用。

4. 离子细胞,去除上清,用流式染色缓冲液重悬细胞,达到细胞终浓度2x105-106/ml。


组织制备


1. 使用酶消化或者研磨法从组织中得到细胞。

2. 用300目尼龙滤网过滤。

3. 离子细胞,去除上清,用流式染色溶液重悬细胞,


全血


无需处理,加入100 ul全血(大概106细胞)



胞 外 染 色


注意点:
1. 抗体拿到后瞬离
2. 抗体4度避光保存,不要冻融。
3. 染色后固定和延后分析将会导致信噪比降低。

实验过程:
针对需要裂红的单细胞悬液(例如脾脏,使用不含固定剂红细胞裂解液,溶血后再标记)
1. 得到单细胞悬液,使用红细胞裂解液裂解红细胞5-10分钟,具体用量和操作可以参照说明书。
2. 离心去除上清,重悬使细胞浓度达到2x107/ml 。(基本上离心之后溶液剩余50-70ul,达到反应浓度)
3. 细胞表面抗体标记。做好同型对照或阴性对照,在冰上或者4度孵育20分钟,也可以在常温下孵育15分钟(具体时间根据抗体说明书)。
4. 加入流式染色溶液,1200转离心5分钟,去上清。
5. 重复步骤8, 再次洗涤去上清。
6. 加入流式染色溶液500 ul或1 ml重悬细胞,上流式检测。 (如果是生物素化或亲和纯化抗体,需要合适荧光二抗标记)
7. 在50-100ul溶液中加入二抗,在冰上或者4度孵育15-30分钟。
8. 重复步骤8两次洗涤细胞。
9. 加入流式染色溶液500 ul或1 ml重悬细胞,上流式检测。

针对需要裂红的单细胞悬液(例如脾脏,使用含有固定剂红细胞裂解液,标记后再裂解,固定操作会影响细胞表面的marker)
1. 得到单细胞悬液,细胞表面抗体标记。做好同型对照或阴性对照,在冰上或者4度孵育20分钟,也可以在常温下孵育15分钟(具体时间根据抗体说明书)。
2. 使用红细胞裂解液裂解红细胞5-10分钟,具体用量和操作可以参照说明书。(注意观察颜色、浑浊度变化)
3. 离心去除上清,500 ul或1 ml重悬细胞,上流式检测。



胞 内 染 色


注:视试剂盒不同,操作步骤有略微更改,BD的固定破膜剂,就需要裂解红细胞,而caltag的破膜剂,带有裂解红细胞作用。

1. 制备单细胞悬液、细胞表面染色。

2. 最后一次洗涤之后,加入固定溶液固定细胞,涡旋,避光孵育10-20分钟。

3. 加入适量1 ml-3 ml缓冲液,离心5分钟,去除上清。

4. 重复步骤3。(使洗涤更加充分,防止固定溶液影响后面破膜效果)

5. 加入破膜溶液。

6. 不同点--有的试剂盒,抗体可以跟破膜溶液同时孵育。避光孵育抗体10-20分钟。

7. 加入适量1 ml-3 ml缓冲液,离心5分钟,去除上清。

8. 用流式染色液重悬细胞,上机检测。

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