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小鼠Th1/Th2的检测

作者:联科生物    发布日期:2019-10-10 08:00

 

1. 检 测 原 理

小鼠Th1/Th2细胞与人的相似,均可分泌多种细胞因子:

•  Th1 细胞主要分泌 IL-2、IL-12、IFN-γ和 TNF-β/α等

•  Th2 细胞主要分泌 IL-4、IL-5、IL-6 和 IL-10

与人相同,鉴别 Th1/Th2同样采用下面的组合:

•  Th1:CD4+IFN-γ+,

•  Th2:CD4+IL-4+

刺激素也是我们通常选用的为PMA(佛波酯)+ Ionomycin(离子霉素)。

与人Th1/Th2不同的是,小鼠淋巴细胞在PMA和Ionomycin的刺激下,其表面的CD4 抗原下降不明显,因此可以用CD4的抗体直接设门分析Th1/Th2。


2. 检 测 方 法 

【 刺 激 阻 断 剂 】

 
供应商 产品名称 货号 规格
MultiSciences PMA/Ionomycin mixture(250X)
佛波酯/离子霉素混合物
CS1001 100ul
MultiSciences BFA/Monensin Mixture(250X)
布雷非德菌素A/莫能霉素混合物
CS1002 100ul


PMA/Ionomycin Mixture (250×) 和BFA/Monensin Mixture (250×) 极易挥发,使用后请及时旋紧管盖。


【破膜剂和流式染色缓冲液】

供应商 产品名称 货号 规格
MultiSciences FIX&PERM Kit GAS006 200T
MultiSciences 流式染色缓冲液 (10×) S1001 125ml

 

【 抗 体 】

供应商 产品名称 货号 规格
MultiSciences Anti-Mouse CD3e (145-2C11), FITC AM003E01 50/100/250T
MultiSciences Anti-Mouse CD4 (GK1.5), PerCP-Cy5.5 AM00407 50/100/250T
MultiSciences Anti-Mouse IFN-γ (XMG1.2), PE AM0IF04 50/100/250T
MultiSciences Anti-Mouse IL-4(11B11),APC AM0I405 50/100/250T
  


【其他可能需要的产品】

供应商 产品名称 货号 规格
MultiSciences 小鼠淋巴细胞分离液 MLSM1092 200ml
MultiSciences 4% 多聚甲醛 F0001 100ml
Thermo Fisher 补偿调节微球 01-1111-41 25 tests

 

【 实 验 步 骤 】 

(1).标本采集及制备

A. 血液标本

小鼠血液标本一般采用眼眶后静脉丛采血法,因此法不需麻醉或处死小鼠,对小鼠的伤害小,且可重复采血,具体方法如下:

•  1)穿刺采用一根特制的长7~10cm硬的玻璃取血管,其一端内径为1~1.5m,另一端逐渐扩大,细端长约1cm即可,将取血管浸入1%肝素溶液,干燥后使用;

•  2)采血时,左手拇指及食指抓住鼠两耳之间的皮肤使鼠固定,并轻轻压迫颈部两侧,阻碍静脉回流,使眼球充分外突,提示眼眶后静脉丛冲血;

•  3)右手持取血管,将其尖端插入内眼角与眼球之间,轻轻向眼底方向刺入,当感到有阻力时即停止刺入,旋转取血管以切开静脉丛,血液即流入取血管中;

•  4)采血结束后,拔出取血管,放松左手,出血即停止。

注:

•  1)用本法在短期内可重复采血。小鼠一次可采血 0.2~0.3ml;

•  2)为适用于 Th1/Th2检测,需用肝素钠来处理取血管,不可用肝素锂、EDTA 或枸橼酸钠。

B. 脾单细胞悬液的制备

脾单细胞悬液的制备通常有两种方法,可依据自己的喜好及习惯来选择。

•  1) 研磨法

Ø 小鼠用 CO2 处死,立即无菌取脾;

Ø 将脾浸入装有冷PBS的培养皿中,用钝头剪刀剪去白色的结缔组织,换入另一个装有冷 PBS的培养皿中以清洗脾脏;

Ø 再次换入一个装有冷PBS的培养皿中;

Ø 用小的弯头手术剪剪切脾脏成3mm3左右的小块;

Ø 用5ml或10ml塑料一次性注射器的尾部背面轻轻按压研磨脾脏小块,此时会看到很多脾单细胞进入PBS中。对于一只30克左右的小鼠,完全研磨脾脏后约可获得100 x 106 左右的细胞;

Ø 经200目筛网过滤获得单细胞悬液,用冷PBS洗涤2次,每次1000r/min, 离心10分钟;

Ø 将细胞悬浮于RPMI1640(含10%热灭活FBS)中,用台酚兰染色计数活细胞数(应在95%以上);

Ø 调节细胞浓度为2 x 106细胞/ml。

• 2) 穿刺法

Ø 小鼠用CO2处死,立即无菌取脾;

Ø 将脾浸入装有冷PBS的培养皿中,用钝头剪刀剪去白色的结缔组织,换入另一个装有冷 PBS的培养皿中以清洗脾脏;

Ø 用 10ml 注射器的针头在脾脏表面密密麻麻穿刺;

Ø 用针头吸取培养皿中的PBS,用力注入脾脏中,细胞即会从小孔中流出;

Ø 彻底冲出脾细胞内的细胞,用玻璃吸管吸取细胞悬液;

Ø 经200目筛网过滤获得单细胞悬液,用冷PBS洗涤2次,每次 1000r/min, 离心10分钟;

Ø 将细胞悬浮于RPMI1640(含 10%热灭活FBS)中,用台酚兰染色计数活细胞数(应在 95%以上);

Ø 调节细胞浓度为 2 x 106 细胞/ml。

C. 淋巴结单细胞悬液的制备

Ø 小鼠用 CO2 处死,立即无菌取出腋下和腹股沟淋巴结;

Ø 将淋巴结浸入装有冷 PBS 的培养皿中,用钝头剪刀剪去脂肪组织,换入另一个装有冷 PBS 的培养皿中以清洗脾脏;

Ø 再次换入一个装有冷 PBS 的培养皿中;

Ø 用小的手术剪剪切淋巴结成 3-4mm 大小的小块;

Ø 在培养皿中放置一个孔径为 20um 的筛网,用 5ml 或 10ml 塑料一次性注射器的尾部背面轻轻按压小块,使得淋巴结的单细胞通过筛网进入其下面的 PBS 液中;

Ø 用冷 PBS 洗涤 2 次,每次 1000r/min, 离心 10 分钟;

Ø 将细胞悬浮于 RPMI 1640(含 10%热灭活FBS)中,用台酚兰染色计数活细胞数(应在 95%以上);

Ø 调节细胞浓度为 2 x 106 细胞/ml。

(2).刺激及染色

• 1a. 对于肝素抗凝血,取125μl 抗凝血至流式管中,加入125μl不含血清的培养基和1μl PMA/Ionomycin Mixture (250×)和 1μl BFA/Monensin Mixture (250×)。取125μl 抗凝血和125μl不含血清的培养基,作为对照。混匀,37℃孵育 4 - 6 小时,每隔1 - 2小时取出震荡混匀。

注:肝素抗凝血样本也可选择方法 B 进行处理,在我们的试验结果中,比全血样本能检测到更多的细胞因子,原因未知。

• 1b. 对于使用其它抗凝剂 (如EDTA、枸橼酸钠)抗凝血,用淋巴细胞分离液 (Cat No: MLSM1092,MultiSicences) 分离外周血单个核细胞 (PBMCs)。用含10%胎牛血清的培养基重悬沉淀,使细胞浓度为1×107/ml。取250μlPBMCs 至流式管中,加1μl PMA/Ionomycin Mixture (250×) 和1μl BFA/Monensin Mixture (250×)。以只含 PBMCs 的样本作为对照。混匀,37℃孵育 4 - 6小时,每隔 1 - 2 小时取出震荡混匀。

• 1c. 对于脾脏组织,使用适当的方法制备成单细胞悬液,并去除团块。

(可选)使用淋巴细胞分离液 (Cat No: MLSM1092, MultiSicences) 分离制备脾单个核细胞。

用含10%胎牛血清的培养基重悬沉淀,使细胞浓度为 1 × 107/ml。取 250μl 细胞悬液至流式管中,加入1μl PMA/Ionomycin Mixture (250×)和1μl BFA/Monensin Mixture (250×)。以只含细胞悬液的样本作为对照。混匀,37℃孵育 4 - 6 小时,每隔 1 - 2 小时取出震荡混匀。

注:在我们的试验结果中,脾细胞经淋巴细胞分离液分离后能检测到更多的细胞因子,原因未知。

• 2.从样本管和对照管中取 100 μl 细胞悬液至新的流式管中,加入 5 μl Anti-Mouse CD3ε, FITC 和5 μl Anti-Mouse CD4, PerCP-Cy5.5。震荡混匀,室温避光孵育 15 分钟。

• 3.每管加入100 μl FIX & PERM Medium A,震荡混匀,室温避光孵育 15 分钟。

• 4.用蒸馏水将10×Flow Cytometry Staining Buffer稀释为1×,每管加入2 ml预冷1×Flow Cytometry Staining Buffer,300 ×g离心5分钟,弃上清。

注:液体尽量倒干净,不要有残留。

• 5.每管加入100 μl FIX & PERM Medium B、5 μl Anti-Mouse IFN-γ, PE和5 μl Anti-Mouse IL-4, APC。震荡混匀,室温避光孵育15分钟。

• 6.每管加入 2 ml 1×Flow Cytometry Staining Buffer,300 ×g 离心 5 分钟,弃上清。

• 7.每管加入500μl 1×Flow Cytometry Staining Buffer 重悬,上机检测;或者加入500μl 1 - 4 %多聚甲醛重悬,2 - 8℃避光,于 24 小时内检测。

(3).流式检测

• 1.调节电压和补偿

推荐使用补偿微球(Cat No: 01-1111-41, Thermo Fisher)对流式细胞仪进行电压和补偿调节。

补偿微球通常比目的细胞小,在调节 FSC/SSC 电压和细胞设门时需要注意。

• 2.正确设门以得到 Th1 和 Th2 细胞在 CD3+CD4+辅助 T 细胞中的比例。

注:至少获取 20,000 - 30,000 CD3+CD4+ T 细胞。对于某一细胞因子,因品系和个体差异,分泌该细胞因子的细胞比例差异很大。为了进行统计学差异比较,请获取足够多的细胞样本。需要注意的是,PMA/Ionomycin 刺激的细胞中,分泌 IL-4 的细胞非常低,甚至可忽略。此时,可考虑 IL-4 的极化培养。

【 结 果 示 例 】

图1:正常 ICR 小鼠的静息肝素抗凝血(A0, B0)、EDTA 抗凝血来源的 PBMCs (C0, D0)、脾细胞(E0, F0)和脾单个核细胞(G0, H0)染色 IFN-γ 和 IL-4。正常ICR 小鼠的 PMA/Ionomycin 刺激的肝素抗凝血(A1, B1)、EDTA 抗凝血来源的 PBMCs (C1, D1) 脾细胞(E1, F1)和脾单个核细胞(G1, H1)染色 IFN-γ 和 IL-4。对 CD3+/CD4+细胞进行设门分析。实验在Thermo Fisher 公司的 Attune NxT 流式细胞仪上进行。
 

3. 其 它 相 关 细 胞 因 子 的 检 测

除 IFN-γ和 IL-4 外,IL-1a、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、GM-CSF和 TNF-α等也是 Th1/Th2所分泌的细胞因子,虽然不是非常特异,但在某些疾病中同样发挥着重要的作用,因此也有检测的必要。

检测这些细胞因子时,要注意所用的刺激剂及刺激方法与 IFN-γ和 IL-4 有所不同,因 PMA+Ionomycin不一定能使这些细胞因子达到最大分泌。所以需参照下表(表1),根据不同的细胞因子,选择最佳的刺激方法。
• 表 1:小鼠 Th1/Th2相关细胞因子的刺激方法

  细胞因子   标本类型   刺 激 剂 及 其 剂 量   刺激时间   再刺激   阻断剂
  IL-1a   小鼠PEC   1) 小鼠 IFN-γ(100ng/ml)   2hr     Monensin
  小鼠PEC   2) LPS(100ng/ml)   22hr  
  IL-2   小鼠脾脏   1) ConA(3ug/ml)   2d   CD3抗体(10ug/ml immobilized) +
  CD28抗体(2ug/ml soluble) 5hr
  小鼠脾脏   2) L-2(20ng/ml)+IL-4(20ng/ml)   3d
  IL-6   小鼠脾脏   1) ConA(3ug/ml)   2d   CD3抗体(10ug/ml immobilized) +
  CD28抗体(2ug/ml soluble) 5hr
  小鼠脾脏   2) IL-2(20ng/ml)+IL-4(20ng/ml)   3d
  IL-10   小鼠脾脏   1) ConA(3ug/ml)   2d   CD3抗体(10ug/ml immobilized) +
  CD28抗体(2ug/ml soluble) 5hr
  小鼠脾脏   2) IL-2(20ng/ml)+IL-4(20ng/ml)   3d
  IL-12   小鼠PEC   1)小鼠 IFN-γ(100ng/ml)   2hr  
  小鼠PEC   2) LPS(100ng/ml)   22hr  
  GM-CSF   小鼠脾脏   1) ConA(3ug/ml)     2d   CD3抗体(10ug/ml immobilized) +
  CD28抗体(2ug/ml soluble) 5hr
  小鼠脾脏   2) IL-2(20ng/ml)+IL-4(20ng/ml)   3d
  TNF-α   小鼠脾脏   1) ConA(3ug/ml)   2d   CD3抗体(10ug/ml immobilized) +
  CD28抗体(2ug/ml soluble) 5hr
  小鼠脾脏   2) IL-2(20ng/ml)+IL-4(20ng/ml)   3d

注:PEC: thioglycolate-elicited peritoneal macrophages,巯基乙醇酸钠释放的腹膜举噬细胞;
ConA :刀豆蛋白 A;
LPS:脂多糖;
hr:hour,小时;
d:day,天

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