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手把手教你做免疫共沉淀实验

作者:佚名    发布日期:2018-02-05 09:00

 


免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

注意:在准备做磷酸(酯)酶实验的时候,不加磷酸酯酶抑制剂。


一、工作液配制

配制 100 ml 的 modified RIPA buffe:

1、称取 790 mg 的 Tris-Base,加到 75 ml 去离子水中,加入 900 mg 的 NaCl,搅拌,直到全部溶解,用 HCl 调节 PH 值到 7.4;

2、加 10 ml 10% 的 NP-40;

3、加 2.5 ml 10% 的去氧胆酸钠,搅拌,直到溶液澄清;

4、加 1 ml 100 mM 的 EDTA,用量筒定容到 100 ml,2~8 ℃ 保存;

5、理论上,蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入(抑蛋白酶肽,亮抑酶肽, 胃蛋白酶抑制剂各 100 μl;PMSF,Na3VO4,NaF 各 500 μl),但是 PMSF 在水溶液中很不稳定,30 分钟就会降解一半,所以 PMSF 应该在使用前现加,其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定 5 天。

 

二、各种成分在工作液中的终浓度

Tris-HCl:50 mM,pH 7.4

NP-40:1%

去氧胆酸钠:0.25%

NaCl:150 mM

EDTA:1 mM

PMSF:1 mM

抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂:各 1 μg/ml

Na3VO4:1 mM

NaF:1 mM


三、实验步骤

1、转染后 24~48 h 可收获细胞,加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上裂解 30 min,细胞裂解液于 4 ℃,最大转速离心 30 min 后取上清;

2、取少量裂解液以备 Western blot 分析,剩余裂解液加 1 μg 相应的抗体加入到细胞裂解液,4 ℃ 缓慢摇晃孵育过夜;

3、取 10 μl protein A 琼脂糖珠,用适量裂解缓冲液洗 3 次,每次 3 000 rpm,离心 3 min;

4、将预处理过的 10 μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中 4 ℃ 缓慢摇晃孵育 2~4 h,使抗体与 protein A 琼脂糖珠偶连;

5、免疫沉淀反应后,在 4 ℃ 以 3 000 rpm 速度离心 3 min,将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去,琼脂糖珠用 1 ml 裂解缓冲液洗 3~4 次;最后加入 15 μl 的 2 × SDS 上样缓冲液,沸水煮 5 分钟;

6、SDS-PAGE,Western blotting 或质谱仪分析。


四、通过免疫共沉淀确定结合蛋白

1、用磷酸盐缓冲液洗 30 块 10 cm 培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到 1 ml 冰冷的 EBC 裂解缓冲液中。

2、将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上 4 ℃ 以最大速度离心 15 min。

3、收集上清(约 30 ml)并加入 30 μg 的适当抗体,4 ℃ 摇动免疫沉淀物 1 h。

4、加入 0.9 ml 的蛋白质 A-Sepharose 悬液,4 ℃ 摇动免疫沉淀物 30 min。

5、用含 900 mmol/L NaCl 的 NETN 洗蛋白 A-Sepharose 混合物,再重复洗 5 次。最后,用 NETN 洗一次。

6、吸出混合物的液体部分。加入 800 μl 的 1 × SDS 胶加样缓冲液到球珠中,煮沸 4 min。

7、将样品加入到大孔的不连续 SDS-PAGE 梯度胶中,在 10 mA 的恒定电流下电泳过夜。

8、通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。

9、从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用 1 ml 50% 乙腈洗两次,每次 3 min。

10、用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质,再将肽电洗脱。

11、通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在 ABI 477A 或 494A 机器上进行自动 Edman 降解测序。

 

五、注意事项

1、细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40 或 Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(0.2% SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,如商品化的 cocktailer。

2、使用明确的抗体,可以将几种抗体共同使用。

3、使用对照抗体:

① 单克隆抗体:正常小鼠的 IgG 或另一类单抗

② 兔多克隆抗体:正常兔 IgG

4、在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性,应注意以下几点:

① 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生

② 要确保抗体的特异性,即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀

③ 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进行蛋白质的定位来确定

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