小鼠脾脏T细胞和人PBMCs 的体外T细胞活化

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作者:联科生物 发布日期:2019-10-22 11:00

成熟T细胞通过TCR识别并与抗原-MHC复合物反应。TCR活化的最直接后果是信号通路的起始,这些信号通路包括诱导特异性蛋白酪氨酸激酶(PTKs)、PIP2分解、PKC活化以及细胞内钙离子浓度的升高。这些早期事件被传递到核,产生诸多效应:
• 1) T 细胞克隆的扩增

• 2) 细胞表面活化标志的上调

• 3) 分化成效应性细胞

• 4) 诱导细胞毒或细胞因子的分泌

• 5) 诱导凋亡

最常用的体外刺激检测T细胞增殖的方法是用TCR的抗原或竞争性抗体活化T细胞。本方案是一个基本方法,用CD3体外刺激小鼠脾T细胞和人类外周血 T 细胞的增殖,关键参数包括细胞密度、抗体滴度和活化动力学。

一、小 鼠 T 细 胞 活 化

用包被的anti-CD3e(145-2C11) 单抗刺激小鼠T细胞;MTT法测细胞增殖。

实 验 材 料

• 1X无菌PBS

• Anti-Mouse CD3ε, Functional Grade (Clone:145-2C11) (MultiSciences, Cat#AM003E)

• Anti-Mouse CD28, Functional Grade (Clone:37.51)(MultiSciences, Cat#AM028)

• RPMI-1640完全培养基

• 无菌的小鼠脾脏或淋巴结单细胞悬液

• 96孔平底带盖微孔板 (Corning, Cat#3596)

• 刀豆蛋白A(ConA),可选 (Sigma, Cat#C5275)

• MTT溶液(MultiSciences, Cat#MTT001, MTT细胞增殖检测试剂盒组分)

• Formazan Solvent(MultiSciences, Cat#MTT001, MTT细胞增殖检测试剂盒组分)

• 红细胞裂解液(MultiSciences, Cat# LYS)

实 验 时 间

• 2 小时包被抗体

• 20 分钟制备脾脏单细胞悬液

• 20 分钟分析设置

• 2-4 天孵育

实 验 步 骤

1. 抗体包被至微孔板:

• 1) 用无菌PBS制备5-10µg/ml的anti-CD3e(145-2C11)抗体溶液,计算所需的抗体量,每个条件或样本需做复孔。例如,包被半块板(48孔板)需要2.6ml抗体溶液。若用其他抗体共刺激时,CD3抗体的浓度可以降低。

• 2) 96孔板中,每孔加入50μl抗体,空白对照孔加50μl无菌PBS。

• 3) 用ParafilmTM 膜将板封好,37℃孵育2小时或4℃过夜。

• 4) 加细胞之前,将孔内的抗体溶液吸去。

• 5) 每孔用200μl无菌PBS洗后,弃去PBS。

• 6) 重复洗一次,去除所有的未结合抗体。

2. 加细胞:

• 1) 取脾脏,无菌制备单细胞悬液,溶血去除红细胞。

• 2) 计数细胞并重悬RPMI-1640完全培养基中,浓度为106/ml。根据实验需要可选择2-3x106/ml~105/ml的浓度。

• 3) 洗板结束后,每孔加200μl细胞悬液,置于潮湿的37°C, 5% CO2培养箱中。可选择加刺激对照:ConA 1-4µg/ml刺激后孵育。

• 4) 加入2-5ug/ml anti-CD28抗体溶液。

• 5) 孵育 2-4 天。可根据具体的实验进行优化。

• 6) 每孔加 20μl MTT溶液,再放回至培养箱中孵育 4 小时。

• 7) 每孔加 50μl Formazan Solvent,轻轻振荡并孵育过夜。

• 8) 第二天分光度计测定OD570和参考波长OD690。

• 9) 计算平均值和标准方差,作图。

相 关 产 品

供应商 产品名称 货号 规格
MultiSciences Anti-Mouse CD3e Monoclonal Antibody, Functional Grade AM003E 20/50/100μg
MultiSciences Anti-Mouse CD28 Monoclonal Antibody, Functional Grade AM028 20/50/100μg
MultiSciences 红细胞裂解液(不含固定剂)(10×) LYS 100/250/500T
MultiSciences MTT细胞增殖检测试剂盒 MTT001 100T
Corning 96孔板,平底,带盖,TC表面,带盖,灭菌 3596 50包/箱

二、 人 T 细 胞 活 化

用包被的CD3 单抗刺激人外周血单个核细胞(PBMCs);MTT法检测细胞增殖。

实 验 材 料

• 1X无菌PBS

• Anti-Human CD3, Functional Grade (Clone:OKT3)(Multiscience, Cat: AH003)

• Anti-Human CD28, Functional Grade (Clone:CD28.2)(Multiscience, Cat: AH028)

• RPMI-1640完全培养基

• 无菌的人PBMCs

• 96孔平底带盖微孔板 (Corning, Cat#3596)

• MTT溶液(MultiSciences, Cat#MTT001, MTT细胞增殖检测试剂盒组分)

• Formazan Solvent(MultiSciences, Cat#MTT001, MTT细胞增殖检测试剂盒组分)

实 验 时 间

• 2-18 小时包被抗体

• 30 分钟制备人PBMCs

• 20 分钟分析设置

• 2-4 天孵育
实 验 步 骤
1. 抗体包被至微孔板:

• 1) 用无菌PBS制备5-10µg/ml的anti-CD3(OKT3)抗体溶液,计算所需的抗体量,每个条件或样品需做复孔。例如,包被半块板(48孔板)需要 2.6ml 抗体溶液。若用其他抗体共刺激时,CD3抗体的浓度可以降低。

• 2) 96孔板中,每孔加入50μl抗体,空白对照孔加50μl无菌PBS。

• 3) 用ParafilmTM 膜将板封好,37℃孵育2小时或 4℃过夜。

• 4) 加细胞之前,将孔内的抗体溶液吸去。

• 5) 每孔用200μl无菌PBS洗后,弃去PBS。

• 6) 重复洗一次,去除所有的未结合抗体。

2. 加细胞:

• 1) 制备 PBMCs 并重悬于RPMI 完全培养基中,浓度为106/ml。根据实验需要可选择2-3x106/ml~105/ml的浓度。

• 2) 洗板结束后,每孔加 100μl 细胞悬液,每个样本重复做3个孔。

• 3) 加入2-5ug/ml anti-CD28抗体溶液。

• 4) 37°C, CO2培养箱孵育 2-4 天。可根据具体的实验进行优化。

• 5) 每孔加 20μl MTT溶液,再放回至培养箱中孵育 4 小时。

• 6) 每孔加 50μl Formazan Solvent,轻轻振荡并孵育过夜。

• 7) 第二天分光度计测定OD570和参考波长OD690。

• 8) 计算平均值和标准方差,作图。

相 关 产 品

供应商 产品名称 货号 规格
MultiSciences Anti-Human CD3 Monoclonal Antibody, Functional Grade AH003 20/50/100μg
MultiSciences Anti-Human CD28 Monoclonal Antibody, Functional Grade AH028 20/50/100μg
MultiSciences 人淋巴细胞分离液 LSM01 200ml
MultiSciences MTT细胞增殖检测试剂盒 MTT001 100T
Corning 96孔板,平底,带盖,TC表面,带盖,灭菌 3596 50包/箱