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人PBMC调节T细胞检测操作步骤

作者:联科生物    发布日期:2019-10-11 08:00

人PBMC调节T细胞检测操作步骤

【 操 作 步 骤 】
1、制备PBMC,并调整细胞浓度至1×10^7/ml。
2、在每个流式管中加入100 μl 准备好的细胞悬液,细胞数约为 1×10^6 个。
3、按照细胞表面抗原染色方法标记CD4和CD25。根据说明书和抗体管上的标识确定抗体用量(联科流式抗体用量一般是5ul)。按个人要求设置空白管、对照管、补偿管和样本管。室温避光孵育15分钟。  
4、用2ml流式染色缓冲液洗涤细胞,300-400 g 离心 5 分钟,去上清。
5、将Fixation/Permeabilization Concentrate和Fixation/Permeabilization Diluent按1:3比例制备成1×工作液(Cat# IC001组分,联科生物)。在流式管中染色,每个样本需要1ml。保存勿超过1天。
6、旋涡震荡重悬细胞后加入1×Fixation/Permeabilization 工作液,并再次旋涡混匀。 室温避光孵育 30 - 60 分钟。
7、用蒸馏水将10×Permeabilization Buffer 稀释为1×工作液。在流式管中染色,每个样本需要8.5ml。剩余溶液在 2 - 8℃最多保存 1 周。
8、无需洗涤,每管加入 2 ml 1× Permeabilization Buffer(Cat# IC001组分,联科生物)。室温下 300 - 400 × g 离心 5 分钟,弃去上清。
9、(可选)重复上一步操作洗涤细胞。
10、加入100 ul PBS 重悬细胞。
11、(封闭可选)体系中加入2%的大鼠血清 2 ul,室温避光孵育 15 分钟。
12、体系加入适量的 Foxp3 抗体,对照管中加入适量的同型对照,具体用量参照说明书(联科流式抗体用量一般是5ul),室温避光孵育至少30分钟。
13、加入 2ml 1×Permeabilization Buffer,室温下300 - 400 ×g离心5分钟,弃去上清。
14、重复上一步操作洗涤细胞。
15、用适量体积的 Flow Cytometry Staining Buffer(Cat# S1001组分,联科生物)重悬细胞,并上机检测并分析。注:由于染色过程中使用了细胞固定和破膜,对比活细胞在形态上会有一定变化(一般是变小),因此 FSC/SSC 图中圈门时需要做一定调整。                                
  • 以上说明书仅供参考,具体实验请对照厂商说明书操作。
  •  

【 相 关 产 品 】
供应商 产品名称 货号 规格
MultiSciences 抗人 CD4, FITC (克隆号:RPA-T4) AH00401 20/50/100T
MultiSciences 抗人 CD25, APC (克隆号:BC96) AH02505 20/50/100T
MultiSciences 抗人 FoxP3, PE (克隆号:PCH101) AH0F04 20/50/100T
MultiSciences 大鼠 IgG2a 同型对照, PE CRG2a04 10/20/50μg
MultiSciences 小鼠 IgG1 同型对照, FITC CMG101 10/20/50μg
MultiSciences 小鼠 IgG1 同型对照, APC CMG105 10/20/50μg
MultiSciences FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Kit IC001 100T
MultiSciences 正常大鼠血清 NRS500 500μl
MultiSciences 人淋巴细胞分离液 LSM01 200ml
MultiSciences 流式染色缓冲液 S1001 125 mL
MultiSciences 4% 多聚甲醛 F0001 100ml
Thermo Fisher 补偿调节微球 01-1111-41 25 tests
 
 
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