小鼠Th1/Th2的检测

检测原理

小鼠Th1/Th2细胞与人的相似，均可分泌多种细胞因子:

• Th1 细胞主要分泌 IL-2、IL-12、IFN-γ和 TNF-β/α等
• Th2 细胞主要分泌 IL-4、IL-5、IL-6 和 IL-10

与人相同，鉴别 Th1/Th2同样采用下面的组合：

• Th1：CD4+IFN-γ+,
• Th2：CD4+IL-4+

刺激素也是我们通常选用的为PMA(佛波酯)+ Ionomycin(离子霉素)。

与人Th1/Th2不同的是，小鼠淋巴细胞在PMA和Ionomycin的刺激下，其表面的CD4 抗原下降不明显，因此可以用CD4的抗体直接设门分析Th1/Th2。

检测方法

【刺激阻断剂】

PMA/Ionomycin Mixture (250×) 和BFA/Monensin Mixture (250×) 极易挥发，使用后请及时旋紧管盖。

【破膜剂和流式染色缓冲液】

【抗体】

【其他可能需要的产品】

【实验步骤】

(1)．标本采集及制备

A. 血液标本

小鼠血液标本一般采用眼眶后静脉丛采血法，因此法不需麻醉或处死小鼠，对小鼠的伤害小，且可重复采血，具体方法如下：

• 1）穿刺采用一根特制的长7～10cm硬的玻璃取血管,其一端内径为1～1.5m，另一端逐渐扩大，细端长约1cm即可，将取血管浸入1％肝素溶液，干燥后使用；

• 2）采血时，左手拇指及食指抓住鼠两耳之间的皮肤使鼠固定，并轻轻压迫颈部两侧，阻碍静脉回流，使眼球充分外突，提示眼眶后静脉丛冲血；

• 3）右手持取血管，将其尖端插入内眼角与眼球之间，轻轻向眼底方向刺入，当感到有阻力时即停止刺入，旋转取血管以切开静脉丛，血液即流入取血管中；

• 4）采血结束后，拔出取血管，放松左手，出血即停止。

注：

• 1）用本法在短期内可重复采血。小鼠一次可采血 0.2～0.3ml；

• 2）为适用于 Th1/Th2检测，需用肝素钠来处理取血管，不可用肝素锂、EDTA 或枸橼酸钠。

B. 脾单细胞悬液的制备

脾单细胞悬液的制备通常有两种方法，可依据自己的喜好及习惯来选择。

• 1) 研磨法

Ø 小鼠用 CO2 处死，立即无菌取脾；

Ø 将脾浸入装有冷PBS的培养皿中，用钝头剪刀剪去白色的结缔组织，换入另一个装有冷 PBS的培养皿中以清洗脾脏；

Ø 再次换入一个装有冷PBS的培养皿中；

Ø 用小的弯头手术剪剪切脾脏成3mm3左右的小块；

Ø 用5ml或10ml塑料一次性注射器的尾部背面轻轻按压研磨脾脏小块，此时会看到很多脾单细胞进入PBS中。对于一只30克左右的小鼠，完全研磨脾脏后约可获得100 x 106 左右的细胞；

Ø 经200目筛网过滤获得单细胞悬液，用冷PBS洗涤2次，每次1000r/min, 离心10分钟；

Ø 将细胞悬浮于RPMI1640(含10%热灭活FBS)中，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)；

Ø 调节细胞浓度为2 x 106细胞/ml。

• 2) 穿刺法

Ø 小鼠用CO2处死，立即无菌取脾；

Ø 将脾浸入装有冷PBS的培养皿中，用钝头剪刀剪去白色的结缔组织，换入另一个装有冷 PBS的培养皿中以清洗脾脏；

Ø 用 10ml 注射器的针头在脾脏表面密密麻麻穿刺；

Ø 用针头吸取培养皿中的PBS，用力注入脾脏中，细胞即会从小孔中流出；

Ø 彻底冲出脾细胞内的细胞，用玻璃吸管吸取细胞悬液；

Ø 经200目筛网过滤获得单细胞悬液，用冷PBS洗涤2次，每次 1000r/min, 离心10分钟；

Ø 将细胞悬浮于RPMI1640(含 10%热灭活FBS)中，用台酚兰染色计数活细胞数(应在 95％以上)；

Ø 调节细胞浓度为 2 x 106 细胞/ml。

C. 淋巴结单细胞悬液的制备

Ø 小鼠用 CO2 处死，立即无菌取出腋下和腹股沟淋巴结；

Ø 将淋巴结浸入装有冷 PBS 的培养皿中，用钝头剪刀剪去脂肪组织，换入另一个装有冷 PBS 的培养皿中以清洗脾脏；

Ø 再次换入一个装有冷 PBS 的培养皿中；

Ø 用小的手术剪剪切淋巴结成 3-4mm 大小的小块；

Ø 在培养皿中放置一个孔径为 20um 的筛网，用 5ml 或 10ml 塑料一次性注射器的尾部背面轻轻按压小块，使得淋巴结的单细胞通过筛网进入其下面的 PBS 液中；

Ø 用冷 PBS 洗涤 2 次，每次 1000r/min, 离心 10 分钟；

Ø 将细胞悬浮于 RPMI 1640(含 10%热灭活FBS)中，用台酚兰染色计数活细胞数(应在 95％以上)；

Ø 调节细胞浓度为 2 x 106 细胞/ml。

(2)．刺激及染色

• 1a. 对于肝素抗凝血，取125μl 抗凝血至流式管中，加入125μl不含血清的培养基和1μl PMA/Ionomycin Mixture (250×)和 1μl BFA/Monensin Mixture (250×)。取125μl 抗凝血和125μl不含血清的培养基，作为对照。混匀，37℃孵育 4 - 6 小时，每隔1 - 2小时取出震荡混匀。

注：肝素抗凝血样本也可选择方法 B 进行处理，在我们的试验结果中，比全血样本能检测到更多的细胞因子，原因未知。

• 1b. 对于使用其它抗凝剂 (如EDTA、枸橼酸钠)抗凝血，用淋巴细胞分离液 (Cat No: MLSM1092,MultiSicences) 分离外周血单个核细胞 (PBMCs)。用含10%胎牛血清的培养基重悬沉淀，使细胞浓度为1×107/ml。取250μlPBMCs 至流式管中，加1μl PMA/Ionomycin Mixture (250×) 和1μl BFA/Monensin Mixture (250×)。以只含 PBMCs 的样本作为对照。混匀，37℃孵育 4 - 6小时，每隔 1 - 2 小时取出震荡混匀。

• 1c. 对于脾脏组织，使用适当的方法制备成单细胞悬液，并去除团块。

(可选)使用淋巴细胞分离液 (Cat No: MLSM1092, MultiSicences) 分离制备脾单个核细胞。

用含10%胎牛血清的培养基重悬沉淀，使细胞浓度为 1 × 107/ml。取 250μl 细胞悬液至流式管中，加入1μl PMA/Ionomycin Mixture (250×)和1μl BFA/Monensin Mixture (250×)。以只含细胞悬液的样本作为对照。混匀，37℃孵育 4 - 6 小时，每隔 1 - 2 小时取出震荡混匀。

注：在我们的试验结果中，脾细胞经淋巴细胞分离液分离后能检测到更多的细胞因子，原因未知。

• 2.从样本管和对照管中取 100 μl 细胞悬液至新的流式管中，加入 5 μl Anti-Mouse CD3ε, FITC 和5 μl Anti-Mouse CD4, PerCP-Cy5.5。震荡混匀，室温避光孵育 15 分钟。

• 3.每管加入100 μl FIX & PERM Medium A，震荡混匀，室温避光孵育 15 分钟。

• 4.用蒸馏水将10×Flow Cytometry Staining Buffer稀释为1×，每管加入2 ml预冷1×Flow Cytometry Staining Buffer，300 ×g离心5分钟，弃上清。

注：液体尽量倒干净，不要有残留。

• 5.每管加入100 μl FIX & PERM Medium B、5 μl Anti-Mouse IFN-γ, PE和5 μl Anti-Mouse IL-4, APC。震荡混匀，室温避光孵育15分钟。

• 6.每管加入 2 ml 1×Flow Cytometry Staining Buffer，300 ×g 离心 5 分钟，弃上清。

• 7.每管加入500μl 1×Flow Cytometry Staining Buffer 重悬，上机检测；或者加入500μl 1 - 4 %多聚甲醛重悬，2 - 8℃避光，于 24 小时内检测。

(3)．流式检测

• 1.调节电压和补偿

推荐使用补偿微球(Cat No: 01-1111-41, Thermo Fisher)对流式细胞仪进行电压和补偿调节。

补偿微球通常比目的细胞小，在调节 FSC/SSC 电压和细胞设门时需要注意。

• 2.正确设门以得到 Th1 和 Th2 细胞在 CD3+CD4+辅助 T 细胞中的比例。

注：至少获取 20,000 - 30,000 CD3+CD4+ T 细胞。对于某一细胞因子，因品系和个体差异，分泌该细胞因子的细胞比例差异很大。为了进行统计学差异比较，请获取足够多的细胞样本。需要注意的是，PMA/Ionomycin 刺激的细胞中，分泌 IL-4 的细胞非常低，甚至可忽略。此时，可考虑 IL-4 的极化培养。

(4)结果示例

图1：正常 ICR 小鼠的静息肝素抗凝血(A0, B0)、EDTA 抗凝血来源的 PBMCs (C0, D0)、脾细胞(E0, F0)和脾单个核细胞(G0, H0)染色 IFN-γ 和 IL-4。正常ICR 小鼠的 PMA/Ionomycin 刺激的肝素抗凝血(A1, B1)、EDTA 抗凝血来源的 PBMCs (C1, D1) 脾细胞(E1, F1)和脾单个核细胞(G1, H1)染色 IFN-γ 和 IL-4。对 CD3+/CD4+细胞进行设门分析。实验在Thermo Fisher 公司的 Attune NxT 流式细胞仪上进行。

其它相关细胞因子的检测

除 IFN-γ和 IL-4 外，IL-1a、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、GM-CSF和 TNF-α等也是 Th1/Th2所分泌的细胞因子，虽然不是非常特异，但在某些疾病中同样发挥着重要的作用，因此也有检测的必要。

检测这些细胞因子时，要注意所用的刺激剂及刺激方法与 IFN-γ和 IL-4 有所不同，因 PMA+Ionomycin不一定能使这些细胞因子达到最大分泌。所以需参照下表(表1)，根据不同的细胞因子，选择最佳的刺激方法。
• 表 1：小鼠 Th1/Th2相关细胞因子的刺激方法

注：PEC： thioglycolate-elicited peritoneal macrophages，巯基乙醇酸钠释放的腹膜举噬细胞；
ConA ：刀豆蛋白 A；
LPS：脂多糖；
hr：hour，小时；
d：day，天