Life Technologies细胞自噬产品

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作者:Life官网 发布日期:2014-04-13 12:00

Life Technologies细胞自噬产品
Life Technologies提供了用于细胞功能和健康检测的各种试剂。其中许多分析以荧光或比色法为基础,具有灵敏性、便利性和安全性。这些产品已经过多种仪器平台验证,包括显微镜、流式细胞仪、酶标仪和高内涵筛选,能够实现各种细胞功能的分析:

? 细胞活性和细胞毒性

? 细胞增殖和细胞周期

? 细胞凋亡

? 自噬

? 氧化应激

? 内吞作用和吞噬作用

? 细胞内离子

自噬是凋亡之外的第二种程序性细胞死亡方式,是进化过程中保留下来的高度保守的自我保护机制,参与自噬的基因从单细胞的酵母到植物、脊椎动物和人中均较为保守。自噬在机体稳定、组织重塑、细胞发育及内环境稳态、生物合成以及环境的适应方面等都发挥着十分重要的作用。

通常自噬的形成主要分为4个步骤,如图1所示:♦ (1)自噬的诱导:细胞在接受自噬诱导信号后,在胞浆的某处形成一个小的类似“脂质体”样的膜样结构,然后不断向两边延伸,成扁平状,称为Phagophore(相当于自噬前体),是自噬发生的标志之一。♦ (2)自噬体的形成:Phagophore不断延伸,将胞浆中的成分包括细胞器及营养成分(正常或异常的)揽入膜内,然后形成密闭的球状结构,称为自噬体(Autophagosome),是自噬形成的标志之一。♦ (3)自噬溶酶体的形成:多个溶酶体与自噬体融合形成自噬溶酶体(Autolysosome)。在自噬体和溶酶体结合时,其外层膜与溶酶体膜融合,内层膜断裂,释放被包裹的物质,♦ (4)自噬体内容物的降解:释放的物质在溶酶体/液泡内部酸性水解酶的作用下发生降解,产物(如氨基酸、核苷、单糖、脂肪酸等)被送到胞浆中,供细胞重新利用,而残渣被排出细胞或滞留在胞浆中。

一、通过LC3B和p62进行自噬示踪

在自噬早期,Phagophore形成时会招募LC3B,可作为自噬膜的标志,并检测自噬的发展过程。Life Technologies的Premo™自噬传感器融合了LC3B荧光蛋白嵌合体(GFP或RFP)和BacMam技术的转导效率,可明确显示活细胞内的LC3B蛋白。该试剂还可耐受甲醛固定,因而可用于固定细胞分析,满足抗体多重实验的要求,也更适于HCS分析。要对自噬过程进行成像,只需将BacMam LC3-FP加入细胞,孵育过夜使蛋白表达即可。

用于自噬作用检测的LC3B抗体试剂盒包含高度特异性的兔抗LC3B 多克隆抗体,经验证可用于荧光显微镜和高内涵成像。它还含有一种可诱导自噬体的对照化合物——采用该化合物处理后,溶酶体pH升高,正常的自噬性流动受到干扰,导致自噬体聚集。 

p62是自噬降解的细胞组分包括泛素化蛋白聚集体的受体,与泛素及LC3结合,因此可示踪蛋白降解。Life Technologies可提供转导效率高、示踪活细胞中p62的试剂,并能兼容细胞标记抗体进行多色分析。

左图示:U2OS细胞转导Premo™ Autophagy Sensor LC3B-RFP(红色)和CellLight®Tubulin-GFP(绿色)。U2OS细胞转导Premo™ Autophagy Sensor LC3B-RFP(红色)和CellLight® Tubulin-GFP(绿色),培养过夜。随后加入60 μM氯喹培养过夜。细胞经1 μg/ml Hoeschst 33342(蓝色)复染后观察。
上图示: Premo™ Autophagy Sensor Tandem RFP-GFP-LC3B可用于区分酸性和中心LC3B阳性囊泡。每个HeLa细胞中转导入40个Premo™ Autophagy Sensor,培养24h,随后加入载体、90 μM氯喹或200 μM亮抑酶肽A孵育24h。氯喹通过中和溶酶体pH值阻断自噬,因此可同时观察到GFP和RFP。而亮抑酶肽A不通过改变溶酶体pH值来阻断自噬,因此在酸性环境下GFP荧光消失,仅能观察到红色荧光。
右图示:使用Premo™ Autophagy Sensor GFP-p62 Kit对p62阳性囊泡沿着微管运动进行成像。A549细胞转导入Premo™ Autophagy Sensor GFP-p62和CellLight® Tubulin-RFP培养24h。加入终浓度60 μM的氯喹培养16h。最后标记Hoeschst 33342染色。

二、溶酶体

溶酶体膜标志可作为追踪自噬体融合的工具。Life Technologies提供含红色或绿色荧光蛋白的CellLight®试剂用于溶酶体膜的定位和示踪,并与其他荧光染料或蛋白兼容操作。另有溶酶体探针试剂,对酸性细胞器具有高度选择性,微量即可有效地标记活细胞,简单高效特异。

上图 使用CellLight™试剂进行活细胞成像。人主动脉平滑肌细胞转导CellLight™ Lysosomes-RFP、CellLight™ MAP4-GFP和Hoechst 33342。 上图 牛肺动脉内皮细胞经MitoFluor™ Far Red 680, LysoTracker® Green DND-26和Hoechst 33342染色成像,分别染色 线粒体、溶酶体和细胞核。