实验时间 | 流式实验胞外/核内步骤小结

单细胞悬液制备

1. 细胞

材料:

消化酶、流式染色缓冲液(推荐目录号S1001)、流式管

操作过程:

  • 悬浮细胞:离心收集细胞,去除上清,用流式染色缓冲液重悬细胞,达到细胞终浓度为2x105-106/mL。
  • 贴壁细胞:用合适的酶消化细胞,(推荐)加入含血清的PBS或者含血清的细胞培养基终止蛋白酶反应,血清中含有抗蛋白酶成分,起到中和作用,防止酶破坏细胞抗原表位,推荐Accutase酶消化细胞,减小细胞损伤(推荐目录号AT001)。然后离心收集,用流式染色缓冲液重悬细胞,达到细胞终浓度为2x105-106/mL。

2. 组织制备

  1. 使用酶消化或者研磨法从组织中得到细胞。
  2. 用300目尼龙滤网过滤。
  3. 离心细胞,去除上清,用流式染色溶液重悬细胞至合适浓度。

3. 全血

无需处理,流式管中加入100 uL全血(大概106个细胞)

胞外染色

注意要点

  1. 抗体拿到后瞬离。
  2. 抗体4℃避光保存,不要冻融。
  3. 染色后固定和延后分析将会导致信噪比降低。

实验过程:

针对需要裂红的单细胞悬液(例如脾脏,使用不含固定剂红细胞裂解液,溶血后再标记)

  1. 得到单细胞悬液,使用红细胞裂解液裂解红细胞5-10分钟,具体用量和操作可以参照说明书。
  2. 离心去除上清,100uL流式缓冲液重悬使细胞密度达到2x107/mL。
  3. 细胞表面抗体标记。做好对照,在冰上或者4度孵育20分钟,也可以在常温下孵育15分钟(具体温度和时间参考抗体说明书)。
  4. 加入流式染色缓冲液,1200转离心5分钟,去上清。
  5. 重复步骤4,再次洗涤去上清。
  6. 加入流式染色缓冲液500 uL重悬细胞,上流式检测。 (如果是生物素化或亲和纯化抗体,需要合适荧光二抗标记)
  7. 在溶液中加入二抗,在冰上或者4度孵育15-30分钟。
  8. 重复步骤4两次洗涤细胞。
  9. 加入流式染色溶液500 uL重悬细胞,上流式检测。

针对需要裂红的单细胞悬液(例如脾脏,使用含有固定剂红细胞裂解液,标记后再裂解,固定操作会影响细胞表面的marker)

  1. 得到单细胞悬液,细胞表面抗体标记。做好对照,在冰上或者4度孵育20分钟,也可以在常温下孵育15分钟(具体时间根据抗体说明书)。
  2. 使用红细胞裂解液裂解红细胞5-10分钟,具体用量和操作可以参照说明书。(注意观察颜色、浑浊度变化)
  3. 离心去除上清,500 uL重悬细胞,上流式检测。

胞内染色

注:视试剂盒不同,操作步骤有略微更改,BD的固定破膜剂,就需要裂解红细胞,而caltag的破膜剂,带有裂解红细胞作用。

  1. 制备单细胞悬液、细胞表面染色。
  2. 最后一次洗涤之后,加入固定溶液固定细胞,涡旋,避光孵育10-20分钟。
  3. 加入适量1 ml-3 ml缓冲液,离心5分钟,去除上清。
  4. 重复步骤3。(使洗涤更加充分,防止固定溶液影响后面破膜效果)
  5. 加入破膜溶液。
  6. 不同点--有的试剂盒,抗体可以跟破膜溶液同时孵育,避光孵育抗体10-20分钟。
  7. 加入适量1 ml-3 ml缓冲液,离心5分钟,去除上清。
  8. 用流式染色液重悬细胞,上机检测。